Диагностика методом ПЦР: современный подход выявления инфекционных и генетических заболеваний

Все чаще в современной медицине можно услышать о ПЦР-диагностике, или полимеразной цепной реакции. Эта услуга может показаться сложной и непонятной для большинства пациентов, но на самом деле это современный метод постановки диагнозов, связанных с инфекционными и вирусными заболеваниями. В этой статье мы расскажем, как работает ПЦР-метод, какие преимущества он имеет и какие этапы включаются в процесс его проведения.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это сложный биохимический процесс, который позволяет умножать исходный ДНК-образец множество раз. Этот метод основывается на использовании фермента, который осуществляет копирование ДНК-цепей. Копирование проходит в специальных пробирках, обеспечивающих оптимальные условия для реакции, которую можно наблюдать в виде ее усиления.

Одно из преимуществ ПЦР-метода заключается в том, что он может обнаруживать вирусы и бактерии, которые не видны при обычном исследовании. Этот метод также позволяет определить наличие этих инфекций в тканях и жидкостях пациента.

Чтобы провести ПЦР-диагностику, необходимо взять материал для исследования — кровь, мочу, слюну или другие биологические жидкости. Затем проводится этап подготовки образца для реакции, после чего он помещается в аппарат для дальнейшей обработки.

Итак, ПЦР-метод является современной и перспективной технологией в диагностике инфекционных и вирусных заболеваний, которая использует определенные этапы и подходы для максимального качества анализа. Если вам требуется постановка диагноза в таком случае, не стесняйтесь обратиться к данному методу.

Существует целый ряд методов диагностики различных заболеваний, однако диагностика методом ПЦР зарекомендовала себя как один из наиболее точных способов выявления инфекций. Методом ПЦР занимаются уже более 30 лет, и за это время он значительно эволюционировал.

Основой метода лежит принцип многократного увеличения микроскопических концентраций фрагментов ДНК возбудителя в биологической пробе пациента в искусственных условиях. Этому способствуют ферменты и изменения температуры (от 50 до 95°С). В результате процесса, называемого амплификацией, из одной молекулы ДНК возбудителя в биологической пробе пациента образуется две. При этом происходит копирование участка ДНК, который присутствует только у того вида патогенного микроорганизма, который интересует врача.

Процесс образования новой молекулы ДНК занимает около 3 минут, и после тридцати-сорока циклов новых молекул становится достаточно для проведения подробного анализа методом электрофореза.

В дополнение к простой амплификации фрагментов ДНК, с помощью ПЦР можно производить и другие манипуляции с генетическим материалом, например, сращивать фрагменты ДНК, вводить мутации и т.д. Из-за этих возможностей ПЦР может использоваться не только для диагностики инфекционных и генетических заболеваний, но и для установления отцовства, клонирования и выделения новых генов.

Процедура ПЦР-диагностики проводится в специальных лабораториях с помощью амплификационного оборудования. Сегодня существует множество различных модификаций ПЦР, включая технологии с использованием не только ДНК, но и фрагментов РНК. В некоторых модификациях можно использовать режим амплификации при постоянной температуре, и для их проведения специальное оборудование не требуется.

Широко применяется такой прием, как «горячий старт ПЦР», при котором пробирки с амплификационной смесью предварительно прогревают при температуре 95°С в течение 3–5 минут, для того чтобы избежать клонирования неспецифических ДНК-фрагментов.

Еще одна популярная модификация ПЦР — мультиплексная амплификация (МПА), которая позволяет проводить исследование сразу нескольких изучаемых фрагментов в одной пробирке. Этот метод не только ускоряет и удешевляет проведение анализа, но и позволяет использовать одни фрагменты, получившиеся в результате реакции, в качестве положительных маркеров для других, что еще больше повышает точность использования ПЦР-диагностики.

Одним из наиболее востребованных методов анализа в клинической медицине является ПЦР-диагностика. Этот метод находит применение в самых различных сферах.

В области урогинекологии ПЦР-диагностика используется для выявления половых инфекций, характеризующихся слабой выраженностью симптомов и часто вызывающих бесплодие и невынашивание беременности у женщин. При помощи ПЦР можно выявить наличие целого «букета» инфекций, включая хламидиоз, несколько видов микоплазмы, уреаплазму, трихомониаз, гарднереллу, кандиду, гонококк и трепонему. Кроме этого, времянка и точность ПЦР-диагностики позволяют выявить генитальный герпес и вирус папилломы человека, предотвращая риск развития злокачественных заболеваний шейки матки у женщин.

В неонатологии ПЦР-диагностика эффективно выявляет наличие неонатальных инфекций у плода уже в утробе матери и у новорожденных. Среди опасных заболеваний отмечаются цитомегаловирус, токсоплазмоз, вирусы краснухи и герпеса, хламидии и микоплазмы.

Пациентам, инфицированным опасными заболеваниями крови или плазмы, такими как ВИЧ, сифилис, гепатиты, также требуется ПЦР-диагностика для избежания риска переливания крови. Метод ПЦР значительно превосходит по точности серологические методы, позволяя выявлять даже инфекции, имеющие длительный инкубационный период, которые не могут быть обнаружены обычными исследованиями в первые несколько недель.

В клинике инфекционных заболеваний ПЦР-диагностика применяется для выявления различных инфекций, включая вирусы гепатита, СПИД, холеры, бруцеллеза, туляремии, дифтерии и токсоплазмоза.

В фтизиатрии и пульмонологии ПЦР-диагностика является неоценимым инструментом для выявления возбудителей атипичных форм пневмонии и хронических рецидивирующих бронхитов, таких как хламидии и микоплазмы. Этот метод также позволяет проводить видовую идентификацию возбудителя и своевременно поставить диагноз туберкулеза.

Помимо клинической медицины, ПЦР-диагностика находит применение в криминалистике, экспериментальной медицине, создании генетических паспортов, мониторинге состояния окружающей среды, анализе продуктов питания, фармакологии и ветеринарии.

Переваги ПЦР-діагностики

Незважаючи на те, що ПЦР-діагностика - метод відносно "молодий", вона отримала широке поширення в медичній практиці через переваги, які надає перед іншими методами аналізу:

• Пряме визначення збудника інфекції. Деякі традиційні методи, такі як імунноферментний аналіз (ІФА), виявляють лише білки-маркери, які є продуктом життєдіяльності збудників інфекції, тому вказують на присутність мікроорганізмів лише косвено. Присутність специфічної послідовності в ДНК, виявленої за допомогою ПЦР, без помилок або майже без помилок показує присутність конкретної інфекції.
• Висока специфічність методу. Вона обумовлена тим, що в досліджуваному матеріалі виявляється фрагмент ДНК, характерний лише для конкретного збудника інфекції. Специфічність ісключає можливість помилкових результатів аналізу, тоді як у імунологічних методах досліджень помилки здійснюються же з моною через перехресну реакцію антигенів.
• Висока чутливість. За допомогою ПЦР-діагностики можна виявити присутність в організмі навіть одиничних клітин вірусів або бактерій в тих випадках, коли звичайними методами це майже неможливо зробити. ПЦР виявляє наявність всього 10–100 кліток в пробі, тоді як імунологічними та мікроскопічними тестами можна виявити наявність інфекції при кількості клітин не менше 103–105.
• Універсальність. Схожість складу всіх ДНК або РНК дає можливість використовувати універсальні методи лабораторних досліджень, діагностікуючи відразу кілька збудників з однієї біологічної проби.
• Швидкість отримання результатів. Оскільки для проведення ПЦР-діагностики не потрібен посів та вилучення культури збудника, то і багато часу на неї не потрібно. Весь цикл – від збору біоматеріалу до отримання результатів – займає 4–5 годин.
• Діагностика латентних інфекцій. ПЦР-методом діагностуються складно культивовані і некультивовані форми мікроорганізмів, які відбуваються в тих випадках, коли захворювання перебігає в прихованій формі.
• Визначення збудника інфекції в інших матеріалах. За допомогою методу ПЦР можна виявити збудників інфекції не тільки в організмі людини, але і в грунті, воді, продуктах харчування.

Ограничения ПЦР-диагностики

Несмотря на то, что метод ПЦР-диагностики считается весьма эффективным, у него все же имеются ограничения. Однако их количество настолько мало, что это не может негативно сказаться на популярности и результативности данного метода.

Вероятность амплификации ДНК возбудителя может сохраняться даже после его гибели. При проведении теста для контроля эффективности лечения, необходимо учитывать определенные требования, в частности, проводить его через некоторое время после полного исчезновения возбудителя инфекции в организме – обычно это занимает от 1 до 2 месяцев.

Существует возможность возникновения перекрестной реакции. Праймеры – это фрагменты ДНК, подбираемые на основе знаний о генетической структуре конкретного возбудителя. Теоретически, такой же фрагмент может находиться в геноме других микроорганизмов, генетический код которых еще не расшифрован. Их наличие в тест-пробе может привести к неверному результату анализа.

Микроорганизмы могут изменяться, что может усложнить анализ при помощи ПЦР-диагностики. Иногда возникновение некоторых штаммов возбудителей может не выявляться в результате таких анализов.

В целях снижения рисков возникновения ошибочных результатов разработаны стандарты объемов испытаний тест-систем ПЦР-диагностики, включающие проверку на перекрестные реакции и тестирование всех известных штаммов конкретного возбудителя.

Метод ПЦР является прецизионной диагностической процедурой, проводимой на нескольких этапах в специализированной лаборатории.

Первый этап - забор биоматериала для исследования, который осуществляется в процедурном кабинете соответствующего профиля. Для диагностики используется эпителиальные соскобы со слизистых оболочек, моча, мокрота, кровь, плазма, сыворотка, биологические жидкости и биоптаты. Забор материала производится при помощи стерильного оборудования только в стерильные пробирки и с соблюдением всех рекомендаций.

Второй этап - хранение и транспортировка биоматериала. Допустимо хранение биоматериалов в течение двух недель при температуре -20°С, но оттаивание и повторное замораживание проб запрещено. Транспортировка, если необходима, должна проводиться в специальных термоконтейнерах или термосах.

Третий этап - выделение ДНК из образца. Метод выделения зависит от вида определяемого микроорганизма и от вида биологического образца.

Четвертый этап - проведение ПЦР. Пробирки с образцами переносятся в специальную микроцентрифужную пробирку, куда добавляется амплификационная смесь. Пробирки устанавливают в программируемый термостат, и автоматическим образом проводится амплификация.

Пятый этап - регистрация результатов. Фрагмент ДНК, характерный для возбудителя инфекции, выделяют методом электрофореза.

Шестой этап - интерпретация результатов исследования. Результат может быть либо положительным, либо отрицательным. Положительный результат говорит о том, что в организме человека обнаружены следы инфекции. На основании количественного результата можно сделать вывод о степени активности заболевания и определить характер лечения.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – метод диагностики инфекций с различным уровнем ценовой политики в разных клиниках. Стоимость ПЦР-анализа зависит от условий процедуры, включая целевые инфекции, виды анализируемого материала, а также методы тестирования – качественные или количественные. Обычно на определение одной инфекции расходуют от 200 до 800 рублей. Ключевым фактором является также оплата за сбор материала – до 400 рублей. В таблице 1 указана средняя стоимость ПЦР-диагностики различных видов.

Многие медицинские центры предлагают комплексное проведение ПЦР-исследования, в рамках которого сразу происходит несколько анализов. Например, «ПЦР-8» (восемь бактериальных и вирусных возбудителей острых кишечных инфекций) – 1400 рублей или «ПЦР-12» (двенадцать половых инфекций) – 3500 рублей. Такая услуга существенно экономит деньги, поскольку отдельный ПЦР-анализ на каждую инфекцию обойдется гораздо дороже.

Фото: freepik.com